Peptide+PROTAC，会是一段什么样的故事？

说到小分子的春天，PROTAC技术当仁不让。目前已经有很多小分子的PROTAC药物在开展临床研究，然而多肽-PROTAC的相关研究却比较少。正如我们所知，多肽介于大分子和小分子之间，有着独特的理化性质，比如多肽可以靶向小分子药物难以靶向的药物靶点，从而使得曾经认为“undruggable”的靶点变成“druggable”；除此之外，小分子的药物导致的耐药作用也可以得到缓解，这是比较好理解的，因为小分子和蛋白靶标的相互作用可能比较少，或者蛋白的“沟槽”可能比较狭窄，因为一个小小氨基酸的突变就会导致分子难以较好的结合，从而导致活性丧失。因此，多肽的PROTAC技术也就应运而生。表1是小分子PROTAC和多肽PROTAC的主要区别。

PROTAC通常被认为是一种双功能分子，在POI（protein of interest）和E3连接酶之间起桥梁作用，从而诱导POI的后续降解。p-PROTAC由以下成分组成，一种基于肽的靶向弹头、一种化学连接物和一种E3泛素连接酶的补充配体（图1）。和小分子PROTAC类似，降解过程大致包括：靶蛋白肽与靶蛋白（POI）结合，E3泛素连接酶配体与细胞内的E3泛素连接酶底物结合区结合，Linker则使靶蛋白与E3泛素连接酶“靠近”，后者利用泛素将靶蛋白标记为缺陷或受损蛋白，之后被标记蛋白由蛋白酶降解清除。

图2显示了一个经典的p-PROTAC的设计方案。首先是蓝色部分（图2，A），也就是p-PROTAC的核心区域，发现并设计有活性的peptide。一般性步骤主要包括：热点残基（即起到关键作用的氨基酸）的分析；根据热点残基设计拟肽，比如为了避免被水解可以引入一些非天然氨基酸等；合成多肽并进行构象测试、与靶标的亲和力测试、以及活性测试；进一步修饰和改造提高构象的稳定性等。这无疑是重要的一步。接下来就是绿色部分(图2，B)，即E3泛素连接酶招募配体的开发，迄今为止，大多数报道的 PROTAC 都选择 VHL 或 CRBN 作为 E3 连接酶，因为它们具有特异性和高亲和力的配体，如图2B所示。

为了保持亲和力和空间效应之间的微妙平衡，连接部分应具有适当的立体化学结构，并提供合适的溶剂暴露位置以将肽靶向弹头与 E3 泛素连接酶招募配体连接起来。目前，氨基酸是 p-PROTAC 中常用的连接部分，包括氨基己酸 (Ahx)、甘氨酸和丝氨酸。聚乙二醇 (PEG) 是另一种经常用于提高 p-PROTAC 亲水性的连接部分。（图2，C）

此外，可以考虑引入一些标签去追踪p-PROTAC在细胞的动态。如荧光标签（FITC 和罗丹明）可用于跟踪 p-PROTAC 的细胞摄取过程和荧光定位。融合亲和标签（生物素等）可以通过免疫沉淀或下拉分析帮助评估 p-PROTAC 的靶向行为。非放射性核素标记、磷酸肽合成和其他修饰方法也应用于肽修饰。但是，我们必须特别注意修饰位置，以免影响p-PROTAC与POI和E3连接酶的结合亲和力以及三元复合物的稳定性。（图2E、F）

值得注意的是，p-PROTAC如此庞大的分子量，结构稳定性差、易降解和跨膜能力差的这些局限性，大大限制了其活性的发挥。于是，考虑从以下几个方面改善其性质，如图表2，连接细胞穿透肽、限制构象，DDS系统或者纳米系统递送等。

根据p-PROTAC三元复合物的构建特点，以下生物物理特性主要包括构象的确定、与POI的结合亲和力、细胞膜通透性和治疗效果的表征。更重要的是，POI 的泛素蛋白酶体依赖性降解过程需要仔细验证。

具体来讲，一般通过圆二色谱去确定多肽的螺旋程度，含有 α-螺旋的肽在圆二色光谱中在 208 nm 和 222 nm 处表现出典型的吸收峰。在肽的给定浓度下，可以通过圆二色光谱在222 nm处的吸收信号强度来评估肽的α-螺旋程度，可用于比较不同p-PROTACs的细胞膜通透性和稳定性。

与POI的结合亲和力，一般通过荧光偏振法 (FP)、等温滴定量热法 (ITC)、表面等离子体共振 (SPR)、微型热泳 (MST) 和免疫共沉淀 (Co-IP) 技术，前四个可以给出其动力学常数。具体的区别见表3.

荧光素标记的 p-PROTAC 的细胞膜通透性可以使用流式细胞术和共聚焦显微镜进行评估。p-PROTAC 的生物活性主要在分子和细胞水平上进行评估。在分子水平上，通常使用蛋白质印迹 (WB) 和定量聚合酶链反应 (qPCR) 来获取 p-PROTAC 对 POI 和相关信号通路的降解能力。在细胞水平上，通常测试细胞活力、细胞增殖和细胞凋亡。

总之，p-PROTAC或许又是一个新的故事的起点，相信未来更多的该方面研究会不断涌现。

参考文献：Jin J, Wu Y, Chen J, et al. The peptide PROTAC modality: a novel strategy for targeted protein ubiquitination[J]. Theranostics, 2020, 10(22): 10141.